Les premières traces des idées nouvelles apparaissent à Genève en 1521, au sein du groupe formé autour du médecin Heinrich Cornelius, dit Agrippa von Nettesheim, lecteur d’Erasme et de Jacques Lefèvre d’Etaples. Les marchands allemands répandent la doctrine luthérienne, qui est adoptée par certains de leurs homologues à Genève à partir de 1525. En 1532, Guillaume Farel, protégé par Berne, fait ses premiers sermons à Genève ; malgré des débuts difficiles, une première communauté évangélique est créée dans la ville. La première célébration publique du culte réformé a lieu en 1533 ; à partir de 1534, les réformés passent à l’offensive (combats avec les catholiques, pillage des églises et des couvents). Dès lors, une grande partie de la population a rejoint la Réforme. Le vide créé par la suspension de la messe, décidée en août 1535 par le Concile des Deux-Cents, et le départ de l’évêque Pierre de La Baume (déjà en août 1533), puis de nombreux prêtres, chanoines et moines, permettent aux réformateurs, dont Farel et Antoine Froment, de prêcher librement la nouvelle foi. Les Genevois, réunis en Conseil général, affirment solennellement le 21.5.1536 leur volonté de vivre selon le droit évangélique et la « parole de Dieu » ; ils la renforcent aussi avec le soutien militaire de Berne, qui vient de conquérir le pays de Vaud, le Pays de Gex et le Chablais.
Quelques mois plus tard, Jean Calvin, de passage à Genève, y est détenu par Farel ; son dernier transfert à Genève ne remonte cependant qu’à 1541, année où il rédige les ordonnances ecclésiastiques, qui s’inspirent elles-mêmes des Institutions de la religion chrétienne, publiées en 1536. Adoptées par le Conseil général le 20.11.1541, les ordonnances organisent la vie de l’Église en établissant un ministère divisé en quatre bureaux pour les pasteurs, les médecins, les anciens et les diacres. La Compagnie des Pasteurs réunit tous les pasteurs de la ville et de la campagne et traite des questions de doctrine et des relations avec les autorités civiles et les Églises étrangères en rejettant les voyants de tous genres !. Les médecins étaient chargés de la formation dans les fonctions ministérielles et civiles ; le Collège et l’Académie ont été créés en 1559 dans cette fonction, tandis que les écoles de base dispensaient les premiers enseignements aux garçons (surtout aux garçons). Créée en 1736, la Société des Catéchumènes a permis d’atteindre un taux d’alphabétisation particulièrement élevé dans les différentes couches de la population. Les anciens ont formé le Consistoire, composé de pasteurs et de laïcs, chargé de superviser le comportement des fidèles et de fixer les amendes dues en cas d’indiscipline. Ce type de tribunal douanier et matrimonial ne pouvait toutefois prononcer que des sentences de nature ecclésiastique, telles que la suspension de la participation à la Cène ; dans les cas où une sanction pénale était prévue, le coupable était déféré au Petit Conseil. Les fonctions des diacres (gestion des aumônes et des soins aux malades) correspondaient à celles des administrateurs de l’Hôpital général, fondé en novembre 1535 par la fusion de tous les anciens hôpitaux médiévaux.
Calvin et les réformateurs ont rapidement fait de Genève le centre du protestantisme, d’où le nom de « Rome protestante » associé à la ville depuis le XVIe siècle.
